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好氧顆粒污泥（AGS）是廢水生物處理領域的一項新技術，是活性污泥絮體在一定條件下自凝聚，最終形成結構致密、形狀規(guī)則的微生物聚合體。成熟的AGS呈球形或橢球形結構，顏色多為橙黃色、棕色、灰褐色。與傳統(tǒng)的活性污泥相比，其具有良好的沉降性、較高的生物量和穩(wěn)定的處理效能，因而極具發(fā)展?jié)撡|。

新疆是主要的番茄醬生產和加工基地，每年7月—10月中旬會產生大量的高濃度有機廢水，此類廢水超標排放會對環(huán)境造成危害。而處理番茄醬這類季節(jié)性的食品加工廢水，需要提前馴化污泥以適應每年的生產季。已有科研人員對在SBR中采用AGS處理番茄醬生產廢水的污泥顆粒化過程進行了分析，并積累了經驗。另外，也有部分學者對AGS的儲存與恢復性能進行了研究。高景峰等分析了AGS在不同儲存方法條件下的恢復效果及影響。但AGS在長期冷凍儲存后處理番茄醬廢水的性能恢復及微生物演替情況研究仍存在空白。

筆者對冷凍儲存260d左右的AGS進行恢復試驗，探究污泥特性，并采用高通量測序技術表征恢復后的微生物群落，旨在尋求適應番茄醬生產周期的合理化廢水處理方式，這對解決AGS長期馴化問題、與實際生產運用的對接和保護水資源具有現實意義。

1、材料與方法

1.1 試驗裝置和運行方式

SBR反應器由有機玻璃制成，其內徑為8cm，高為100cm，有效容積為4L。反應器底部設有曝氣裝置，控制溶解氧（DO）在8mg/L左右，pH保持在7.0~7.5之間。一個運行周期為4h，每天運行6個周期，共進行130d。其中，進水10min、曝氣200min、初始沉降時間為28min、出水2min。

1.2 接種污泥

試驗接種污泥取自實驗室采用配制番茄醬廢水培養(yǎng)了185d的AGS，質量為200g，MLSS為5750mg/L，MLVSS為4830mg/L，MLVSS/MLSS為0.84，在-18℃環(huán)境下于清水瓶中恒溫冷凍保存約260d。AGS外觀呈淺褐色球形或橢球形，結構較為密實、光滑（見圖1），顆粒粒徑平均為8mm，最大可以達到11mm。

體視顯微鏡顯示，部分顆粒的表面存在孔洞，是為顆粒內部傳遞營養(yǎng)物質和輸送氣體的通道。在長期的低溫環(huán)境中儲存后，細菌凋亡，活細菌逐漸減少，生物活性降低，一些顆粒發(fā)生了破裂。

1.3 試驗水質

試驗水質采用人工合成的番茄醬加工廢水，以鮮榨番茄汁提供碳源，COD濃度為800~1400mg/L，NH4+-N、PO43--P分別由氯化銨（NH4Cl）和磷酸氫二鈉（Na2HPO4）配制，濃度分別為50、10mg/L。采用無水碳酸鈉（Na2CO3）調節(jié)pH。常量元素和微量元素的配制參照文獻。

1.4 分析項目及方法

COD、NH4+-N、PO43--P、MLSS、MLVSS和污泥容積指數（SVI）等采用《水和廢水監(jiān)測分析方法》（第4版）測定，DO采用溶解氧儀測定。

高通量測序：取適量不同時期的顆粒污泥分別放入已滅菌的2mL離心管中進行提取，在0℃下保存。取4個時期的污泥樣品，分別編號為D1（65d污泥）、D2（90d污泥）、D3（120d小顆粒污泥，粒徑為0.45~2mm）、D4（120d大顆粒污泥，粒徑為3~4mm）。DNA提取和PCR引物擴增均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，提取的具體過程參照E.Z.N.ATMMag-BindSoilDNAKit的基因組DNA提取試劑盒說明書。電泳條件為1%瓊脂糖凝膠、1×TAE的電泳緩沖液、110V的電壓、15min。擴增片段為16SrDNA的V3-V4，片段大小為400bp左右。PCR引物為341F（CCTACGGGNGGCWGCAG）和805R（GACTACHVGGGTATCTAATCC）。

2、結果與討論

2.1 活性恢復過程中污泥的物理特性

圖2為AGS活性恢復試驗不同時期的照片。

從圖2可以看出，培養(yǎng)第2天的AGS開始松散、解體，出現帶狀剝落層，出水渾濁，MLSS只有4330mg/L，MLVSS/MLSS為0.58。接種后第7天，MLSS達到5590mg/L，部分顆粒停止破裂，形態(tài)由松散向圓實轉化，顆粒表面變得光滑瑩潤、顏色加深、顆粒增多、粒徑縮小。到第13天時，MLSS降到4340mg/L，粒徑在4mm以上的顆粒污泥占34.7%，小于0.45mm的達到22.3%。當第20天時，大顆粒污泥消失，基本為2~4mm的黃色扁平狀小顆粒，部分空洞，平均沉降速度提高到66.47m/h，出水水質清澈。第35天再次發(fā)生變化，空洞的顆粒污泥解體消失，成長為密實的黃褐色橢球形污泥，粒徑在0.45~1mm之間、由絮狀污泥新生的小粒徑污泥質量比過半，MLSS為5632mg/L。第100天時，粒徑為0.45~2mm的新生顆粒占到68%，大于4mm的顆粒質量比不超過10%，MLSS穩(wěn)定在8000mg/L左右。最終，第130天時，0.45~4mm的粒徑占比超過75%，占主導地位。

分析原因，好氧顆粒污泥經過長期低溫儲存后，死菌和活菌相互分離從顆粒中脫落。起初2d，一部分膠體溶于水中，增加了懸浮物濃度，而另一部分則解體分散，以晶核形式重新顆?；５降?天，出現大量的絮體污泥，說明新一代微生物已經開始生長繁殖，出水水質變好，預示著污泥活性開始恢復。緊接著通過縮短沉降時間來截留具有活性的污泥，致使MLSS降低。第35天開始，顆粒污泥結構穩(wěn)定，去除率高，微生物量豐富，已經完全恢復了好氧顆粒污泥的良好性質，標志著顆?；瓿?。此后，第二代新生小顆粒污泥質量比逐漸提高，系統(tǒng)運行趨于穩(wěn)定。

2.2 活性恢復過程中污染物的去除效果

在污泥活性恢復過程中對污染物的去除效果如圖3所示。

從圖3（a）可知，進水COD為800~1400mg/L?；謴驮囼灥?天，進、出水COD分別為1264.47、203.63mg/L，去除率為83.90%，達不到出水水質標準。第6天時，去除率約為90%。后期即使進水COD上下波動明顯，去除率仍然保持在90%以上，最高達98.7%，平均在95%，達到了冷凍儲存前的COD去除效果。說明好氧硝化細菌活性良好，已經完全恢復了AGS的除污特性。絮狀污泥與顆粒污泥共存的兩相污泥沒有降低COD去除率。

從圖3（b）可知，進水NH4+-N為42.12~62.46mg/L，出水水質波動較大。第2~7天，出水NH4+-N平均為34.61mg/L，去除率只有34.67%，活性恢復才剛開始。隨后兩周，NH4+-N去除率持續(xù)上升。到第20~35天，出水NH4+-N平均濃度降到9.41mg/L，最低為3.11mg/L，去除率提高到80%以上，最高達到93%。但因為此時顆粒污泥的結構并不完整，多為扁平狀，破壞了AGS的好氧-兼氧-厭氧空間結構，缺乏厭氧菌，致使反硝化反應不徹底。第35天后，顆粒結構重新穩(wěn)定，空洞部分形成了厭氧區(qū)，NH4+-N去除效果變好。到了第60天后，縮短沉降時間至5min，大量污泥從系統(tǒng)流失。同時，此時進入冬季，水溫在10~15℃之間，微生物活性受到抑制，絮狀污泥生長緩慢，顆粒污泥減少，使得NH4+-N去除效能下降。隨后為提高MLSS，沉降時間調至25min，第90天之后，顆粒污泥逐漸恢復，穩(wěn)定后NH4+-N去除率在82%左右，但依舊不能恢復到90%以上，主要是受溫度的影響。

從圖3（c）可以看出，進水PO43--P濃度約為11mg/L，出水PO43--P濃度最低為0.87mg/L，整體變化趨勢與NH4+-N相似。波動起伏后，去除率最終在第105天恢復到80%以上。

2.3 微生物群落高通量宏基因組測序分析

AGS內部存在厭氧、兼氧、好氧復雜的空間結構，不同的區(qū)域能夠為各功能微生物提供適宜的生存條件。在硝化細菌、反硝化細菌及異養(yǎng)菌共同作用下，可以實現同步脫氮除磷。因此，分析AGS的微生物群落、優(yōu)勢菌群有助于探究AGS活性恢復機理。為此，在研究冷凍顆粒污泥物理活性恢復和污染物去除效能的基礎上，通過高通量宏基因組測序手段，對活性恢復第65、90、120天的AGS樣品的16SrDNA的V3-V4進行擴增，從而獲得有效序列。

2.3.1 微生物的多樣性

使用相似性97%的操作分類單元（OTUs），利用Mothur軟件進行稀釋性分析，微生物稀釋曲線如圖4所示。曲線光滑平整，說明檢測到的微生物信息量大且穩(wěn)定，4個樣品的曲線都趨于平坦，表明測序結果涵蓋了樣品中絕大多數微生物信息。

圖5為微生物群落的Venn圖。

從圖5可知，4個樣品的總OTUs數為13260個，共同重疊的為220個，占OTUs總數的1.66%，表明伴隨著顆?；^程，微生物群落組成發(fā)生了較大改變且存在一定的相似性。

當達到飽和測序時，所獲得的物種最大數量由Chao1指數表征。顆粒污泥形成過程中，Chao1指數的排序為D1>D4>D3>D2，見表1，表明樣品豐富度不斷發(fā)生變化。D1時期物種豐富度較高，D2、D3階段物種豐富度降低，D4階段又得到恢復。

2.3.2 微生物群落在門水平上的差異

不同時期污泥樣品細菌在門水平上的分布情況如圖6所示?？芍?，在4個檢測樣本（D1~D4）中，細菌在門水平上分類數目分別為14、13、16、14。從4個樣品的檢測結果來看，無論在哪個階段，變形菌門（Proteobacteria）都占到細菌門類總數60%以上，擬桿菌門（Bacteroidetes）在各個階段的占比均在20%以上，可見Proteobacteria和Bacteroidetes為主要門類，對降解番茄醬生產廢水起著重要作用，這與陳啟偉等的結果一致。Proteobacteria由于涵蓋的菌株豐富和代謝途徑的多樣性，作為優(yōu)勢門類在各種廢水生物處理系統(tǒng)中也被報道，如焦化廢水、寵物食品工業(yè)廢水、制藥和煉油廠廢水等。同一時期不同粒徑的污泥因其結構不同，微生物群落存在差異。D3、D4為同一時期不同粒徑的污泥樣本，兩樣本間的微生物存在細微差異。較明顯的是綠彎菌門（Chloroflexi）在D3時期出現（占0.02%），然而在D4中又消失不見，說明此菌門存在于120d時的小粒徑（0.45~2mm）污泥中。另外，厚壁菌門（Firmicutes）在D3中的含量為0.11%，在D4中的含量為0.52%。

從圖6還可以看出，污泥中的微生物菌群也發(fā)生著變化。疣微菌門（Verrucomicrobia）從D1時期的1.49%上升到D3時期的3.09%，Firmicutes由4.3%降到了0.11%。同時期裝甲菌門（Armatimonadetes）的變化也較大，由0.68%下降到0.03%。在此期間，污泥濃度也是在不斷變化的，Verrucomicrobia的增多是由于污泥濃度增大引起的。同時，系統(tǒng)對NH4+-N和PO43--P的去除率也在逐漸升高，這說明Firmicutes和Armatimonadetes的減少對NH4+-N和PO43--P的去除有一定的積極作用，這是微生物群落演替的結果。

值得一提的是，浮霉菌門（Planctomycetes）的占比在D1~D4時期持續(xù)上升。而Planctomycetes的浮霉菌屬（Planctomyces）和小梨形菌屬（Pirellula）等都屬于專性好氧菌。與此同時，在Planctomycetes中還存在一類和Planctomyces等關系較遠的細菌，由于暫時無法分離獲得純菌株，因此尚未能正式命名和分類（如CandidatusKuenenia、CandidatusScalindua、CandidatusBrocadia屬），它們能夠利用亞硝酸鹽在缺氧環(huán)境下氧化銨離子生成氮氣來獲得能量，因此稱作厭氧氨氧化菌。在該過程中，對NH4+-N的去除效果變好，說明該種菌對廢水中NH4+-N的去除做出了貢獻。這也顯示，該類細菌的富集將有助于短程硝化反硝化過程，對水生態(tài)環(huán)境的氮循環(huán)及番茄醬加工廢水的高效降解具有重要意義。

2.3.3 微生物群落在目水平上的差異

各樣品細菌在目水平上的分布情況如圖7所示?？梢钥闯?，紅環(huán)菌目（Rhodocyclales）、鞘脂桿菌目（Sphingobacteriales）為主要菌目，兩菌目占比之和約為50%。伯克霍爾德氏菌目（Burkholderiales）、黃桿菌目（Flavobacteriales）和嗜甲基菌目（Methylophilales）的變化較大。Burkholderiales在D3時期數量最多，而D3時期系統(tǒng)絮體污泥的占比較小，說明Burkholderiales在顆粒污泥中的量要多于在絮體污泥中的，這與已報道的Burkholderiales為番茄醬廢水的主要降解菌結論一致。Flavobacteriales的分布情況與Burkholderiales相反，其在D2中的占比要大于在D1和D3中的，更容易存在于絮體污泥中。Methylophilales的分布情況與Burkholderiales類似，其在顆粒污泥中的占比大于在絮體污泥中的。

從圖7還可以看出，一些細菌在生長過程中被淘汰了，同時伴隨一部分新的菌目出現。如梭菌目（Clostridiales）存在于D1和D2樣品中，而在D3樣品中消失。再如紅細菌目（Rhodobacterales）在D1與D2中的數量明顯高于在D3與D4中的?？梢姡煌瑫r期不同菌群表現出的協(xié)同或者競爭關系，即微生物群落的演替是活性污泥微生物有效降解有機物的驅動力，對反應體系的穩(wěn)定性具有重要作用。

3、結論

①恢復初期顆粒污泥最大膨脹到11mm并出現破裂解體現象，13d后顆粒污泥開始穩(wěn)定恢復活性，到第20天時，部分存在空洞，出水水質變清澈，逐漸恢復了AGS性能。第35天以后，空洞的顆粒污泥解體、消失，密實的橢球污泥形成，已經完全恢復了AGS的良好性質，標志著顆粒化完成。最終，第130天時，0.45~4mm的粒徑占比超過75%，占主導地位，MLSS穩(wěn)定在8000mg/L左右。

②恢復再生后的顆粒污泥對COD、NH4+-N和PO43--P的平均去除率分別在95%、82%和80%以上。高通量測序結果顯示，不同時期菌群的多樣性不斷變化，物種的均勻性逐漸上升。在門水平上，變形菌門和擬桿菌門之和占到總污泥菌群80%以上，是優(yōu)勢菌群。浮霉菌門的占比在D1~D4時期持續(xù)上升，它的屬中有一類細菌稱作厭氧氨氧化菌，對氮循環(huán)及番茄醬加工廢水的高效降解具有重要意義。在目水平上差異明顯，紅環(huán)菌目和鞘脂桿菌目是處理番茄醬廢水的主要菌目。伯克霍爾德氏菌目在顆粒污泥中的分布要多于絮體污泥，也是番茄醬廢水的主要降解菌。